174期未明确诊断的线粒体抗体阳性的原发性胆汁性胆管炎患者特征的研究-北京医学感染与传染研究
?论著?
未明确诊断的线粒体抗体阳性的原发性胆汁性胆管炎患者特征的研究
吴静 译；孟庆华 审校
（Dahlqvist,et al;Large-Scale Characterization Study ofPatients With Antimitochondrial Antibodies but Nonestablished Primary BiliaryCholangitis . HEPATOLOGY.2017; 65(1）:152-163)
【摘要】背景：对无原发性胆汁性胆管炎（PBC）临床证据，但有抗线粒体抗体（AMAS）的患者的流行率、临床特征以及转归知之甚少。方法：法国63所免疫学实验室对抗线粒体抗体的发生率进行了前瞻性研究。临床数据来自1318名在一年内确诊线粒体抗体阳性患者中的720位。患者被分为新近诊断的PBC组（n=275）、早前确诊的PBC组（n=216）和未明确诊断的PBC组（n=229）。对后一组进行了明确评估。收集了在检测到抗线粒体抗体后随访7年的数据。结果：无PBC指征但线粒体抗体阳性患者的流行率为16.1%。这些患者有一些特征：78%为女性；中位年龄为58岁；AMA的中位滴度为1:160；肝外自身免疫紊乱的发生率为46%；血清ALP正的发生率为74%；ALP高于1.5倍正常上线的占13%及有6%的患者有肝硬化。与新近诊断为PBC的患者相比，这些患者年龄较小、AMA滴度低、性别比例失衡较轻。ALP正常以及没有肝硬化证据的患者5年内发展为PBC的占16%。尽管没有患者死于PBC， 5年生存率为75%，但在经过年龄性别配对的标准对照组中五年生存率为90%（P＜0.05）。结论：将近一半的新近确诊的AMA阳性患者在临床诊治过程中并未诊断为PBC。这些病例中的13%未被确诊为PBC。只有1/6的AMA阳性以及ALP正常的患者在5年后发展为PBC。AMA阳性但并未诊断为PBC的患者的死亡率在增加无论是否有发展为PBC的风险。
原发性胆汁性胆管炎（PBC）是一种不明确的慢性肝胆管疾病，但可能为一种自身免疫性，初发症状为ALP升高血清AMAs阳性并高度预示着组织损伤，也就是肝活检表现为小叶间胆管的肉芽肿性或淋巴细胞性非化脓性胆管炎。
临床诊疗中规范化检测AMA有利于该病的早期诊断及管理，避免了大多数病人发展为终末期肝病，至少部分原因是使用了熊去氧胆酸，它是治疗该病的一线用药，该药目前已获药监局及国际医学会的认可。
在ALP异常的PBC患者中AMAs被认为是高度特异性(≥95%)的，因此对于存在无法解释的ALP升高和血清AMA阳性的患者在没有活检的情况下可以明确的诊断为PBC。然而也大量报道了在没有任何症状和体征的疾病中检测到AMA，特别是肝外自身免疫紊乱的患者例如硬皮病、干燥综合征、或者是自身免疫性甲状腺病，还包括肝内或肝外非自身免疫性疾病患者，例如慢性丙型肝炎或者是血液系统肿瘤。在这种情况下，纵向研究表明，赵cAMAs不可避免地与PBC的进展相关，但是这些研究较久远，都是在单一的英国区域或者局限的地区，并且总共不超过29人。
目前为止，在PBC临床适应证缺乏的情况下，没有大型的前瞻性研究来评估AMAs的特殊意义。因此此研究的目的是在很大程度上前瞻性评估AMAs阳性但并未明确诊断为PBC患者的流行，临床特征以及结局。
患者和方法
研究的设计与人员
这是一个在2006年6月-2013年9月期间在法国范围内进行的前瞻性观察性研究。这是一大约90%法国城市领域上的63家实验室构成的临床免疫学实验室网络。实验室的地理位置见表1。研究的初始目标是在法国评估根据临床实践中的常规检查新诊断为AMAs阳性患者的发病率。基于这个目的，在2006年5月-2007年6月的AMAs阳性检查都会记录在一个安全的web数据库中，通过这个数据库病人可以注册一个匿名账户可以看见就诊医生的名字和住址。这构成了为期一年的人口普查阶段的研究。所有的实验室均使用一线检查方法以及诊断流程。按照国际建议，血清AMAs应用间接免疫荧光首先在小鼠肝、肾及胃组织检测AMAs。每种抗体滴度大于或等于1:40即定义为阳性，接下来便用免疫斑点或者蛋白质印迹法来证实。在证实试验中，大部分实验室使用备用的免疫斑点检测试剂盒。法国圣安托万医院的诊断学实验室使用他们自己的免疫斑点方法。PBC特异性抗核抗体（ANAs）即在Hep-2细胞中检测到ANA和膜周/膜上或多位点免疫荧光标记，抗体滴度大于或等于1:80被认为是有意义的。
在集中数据并对其进行匿名化后，研究者会联系及邀请主治医师对病人的病史、临床、生化和组织学特征做一相关的问卷，并且告知是否可以做出PBC的诊断（诊断是基于现有条件下主治医师的建议）。问卷所包含的条目会在表S1呈现。所有患者会由他们的主治医师告知如果他们不反对，他们的一些医学数据将会用于自身免疫特定领域的研究。根据得到的数据信息，病人被分为以下三种情况的其中一组：⑴新近诊断的PBC患者；⑵先前诊断的PBC患者；⑶未诊断为PBC的患者。
考虑到研究的目的，研究重点是第三组，前瞻性随访数据通过要求主治医师在人口筛查后2、4、5、7年分别做的第二份问卷来获取，主治医师会告知随着时间的变化，病人的健康与诊断状况。这便是研究的随访阶段。第二份问卷包含的相关条目会在表S2呈现。PBC患者的生存率及死亡率通过这些检查报告直接估计木星合月 。
统计学分析
统计学分析描述性统计以中位数或率（百分数）表示。考虑到AMA筛查的地域覆盖率、处方医师的参与率和AMA阴性的PBC患者的10%的预期比例，AMA和PBC的发病率是通过将1年期普查期间登记发病病例数量除以同期法国城市总人数来表示。按性别和10岁的年龄组别分别计算率。假设这些率随时间恒定不变，那么时点患病率可以通过以下公式估计：患病率=发病率×平均寿命。平均寿命通过一个包括378位年龄相近的1985年-2005年在法国圣安托万医院随访的患者的队列研究来估计。如果合适，连续性变量组间比较使用t检验或者Mann-Whitney U检验，分类变量用卡方检验或Fisher精确检验。由于生存数据通过固定的时间间隔而不是使用精确的死亡日期（该变量容易缺失），生存率用一年固定间隔的精确方法（寿命表法）来计算。经过年龄，性别以及随访时间配对的标准人群作为对照组。这些人口生存率的估计通过法国官方人口普查表获得。观察和预期存活率使用log-rank检验比较。预后变量通过Cox回归模型来分析。PBC的累计发病率通过使用处理死亡风险的非参数方法来估计。不适用上述分析方法的是ALP高于正常上限(ULN)1倍以上，瘙痒，硬化或者有PBC引起的组织相容性病变（这些可能是或潜在的PBC）。
伦理审查委员会批准认可
该研究在收集数据前得到法国健康研究数据处理咨询委员会及国家信息和自由委员会的认可。
结果
已确诊或未确诊的PBC且AMA阳性患者的发病率或患病率
在研究的疾病筛查阶段共有1318名患者注册登记了1367项AMA阳性检查（表2），不同实验室在这段时间内AMA检查的数量差异较大（范围，64-18500；中位数，563），但是，阳性结果所占比例接近，在所有检查中平均为2.5%（95%置信区间为1.6-3.5；附表S3）主治医师征得了1149（87%）的AMA阳性患者的同意。相关的医学信息只能在772（67%）名患者中收集，而数据真正可利用的只有720（63%）位患者。在这720位患者中有275（38%）位新近诊断为PBC、216位（30%）原有PBC、229位(32%)为未确诊的PBC(表2)。AMAs和PBC的年发病率分别为1.7/10万和1.0/10万。由于年龄和性别的不同这些率也会有变化（表3），AMA阳性的男性患者比女性多4倍，患PBC的男性患者比女性多6倍。无关性别冢越博隆，发病率在20岁时会直线上升并在80岁达高峰（表3）。据估计AMA和PBC的患病率分别为40.4/10万，24.3/10万。未确诊为PBC但AMA阳性患者的患病率位16.1/10万。
未确诊为PBC但AMA阳性患者的特征
229位未确诊PBC但AMA检查阳性患者的临床特征见表1。这些患者大多为女性（78%），年龄在40岁以上（中位年龄58岁）。AMA的中位滴度为1:160。对150位（66%）患者的标本做了免疫斑点/蛋白质印实验，在这些患者中只有91的患者结果阳性。没有用二线方法检查的患者和已做过相关检查的患者的AMA滴度及人口学特征相差不大（数据未显示）。PBC特异性ANAs患者占6%。在将近一半（46%）的病例中，这些抗体可用来评估自身免疫紊乱。最常见的自身免疫性疾病是系统性红斑狼疮(n=18;8%)，干燥综合征(n=14; 6%)，和自身免疫性肝炎(AIH：n=10； 4%)。有12%的非自身免疫性肝病患者AMA阳性。这些非自身免疫性肝病最常见的是慢性肝炎(n=8; 3%)和酒精性肝病(n=8; 3%)。所有已查出AMA阳性的临床病例可在附表S4中查到。遗憾的是，由于纵向数据太少，AMA持续阳性率不能获知。
完全或部分生化数据只能在130(57%)名患者中获取。中位血清总胆红素、ALP、丙氨酸转氨酶(ALT)和免疫球蛋白M(IgM)均在正常水平，而γ-谷酰胺转肽酶轻微高于正常上限(表 1)。血清ALP和整套肝生化检查（包括胆红素、ALP、 GGT、和ALT）分别在74%和44%的患者中是正常的。有13%的病例的ALP高于正常上限1.53×ULN而不能用非PBC疾病(肝肿瘤、药物引起的肝损伤或者其他可确定的肝疾病)可解释。对获取数据的148位患者中的28位(19%)进行了肝活检，由于没有胆管损伤或者肉芽肿星海领主，因此没有组织学报告支持PBC的诊断。
组织学报告提示可包括正常组织、轻微门静脉炎、脂肪性肝炎、组织学特征与AIH或者肝硬化相似。13位(6%)患者有经组织学或临床或超生诊断的肝硬化，这13例患者中有一半（n=7）的患者有酒精滥用的情况。4位患者(30%)的肝硬化原因不明。免疫斑点或蛋白质印记阴性（n=13）与阳性患者（n=137）有相似的特征（见附表S5）。相似的，AMA间接免疫荧光滴度低（=1：40，n=36）的患者与滴度高（≧1:80，n=193，附表S6）的患者的特征并无显著差异。
与同时期新近诊断为PBC的患者(n=275,可分析n=247)相比，未明确诊断为PBC的患者较年轻、并发症较少，两组患者疲乏的症状无差别，但是瘙痒和黄疸在未明确诊断PBC组更少见。他们的AMAs滴度税法基础知识，PBC特异性ANAs，以及血清总胆红素、ALP、 GGT、 ALT andIgM水平显著低于后组，性别失衡轻于后组（表2）。同时，他们也较少被建议去做肝穿，以及较少发生肝硬化。最后，两组之间有类似的自身免疫紊乱的个人史及家族史。
未明确诊断PBC但AMA阳性患者的临床结局
随访数据来自在疾病筛查阶段的最后生存的222位患者中的92名(41%)，平均随访时间为4.0±1.8年（区间，0.5-7.3）。将所有死亡患者考虑在内（包括在筛查阶段死亡病例，）在整个研究阶段共有20名(9%)患者死亡。只考虑随访期，92名随访的患者中有17名(18%)死亡。死亡年龄中位数为73.6岁（范围，42-90岁）。死亡原因如下：5名患者死于非肝脏肿瘤（支气管鳞状细胞癌1位；肺腺癌1位；原病灶未明的转移性腺癌3位）；4名患者死于血液恶性肿瘤(非霍奇金淋巴瘤2位；急性髓性白血病1位；多发性骨髓瘤1位)；3名患者死于感染性疾病(肺炎2位；感染性心内膜炎1位)；2名患者死于心血管疾病（多种原因导致的心衰1位；慢性肺心病1位）；3名患者死于消化系统疾病（慢性酒精性肝衰2位；急性重症胰腺炎1位）；3名患者死亡原因不明。没有患者死于PBC。精确的Kaplan-Meier生存曲线见图4。1、3、5年的生存率分别是95%(95% CI, 92-98)、90%(95% CI,85-96)和75%(95% CI石子坚, 63-87)。这些数值显著低于对照组，对照组患者3年的生存率分别为99% (95% CI,97-100)、 96% (95% CI, 92-100) 和 90% (95% CI,83-98)（P=0.023）
在随访的92例患者中发现有9例进展为PBC，其中8例(89%)是女性患者。诊断PBC的中位年龄为62.1岁（范围，35.9-69.8岁）。在排除基线时就有ALP升高、瘙痒及肝硬化的患者（92例患者中的66例）且考虑竞争死亡风险后计算发病率。发病率曲线见表5。PBC在1、3、5年的累积发病率分别为2% (95% CI, 0-7)、7% (95% CI, 2-15)和16% (95%CI, 6-29)。年龄、性别、AMA滴度、PBC特异性ANAs、自身免疫性肝炎的个人史家族史或者血清ALP、GGT、ALT、或 IgM基线水平均不是预测PBC进展的因素（表3）。PBC的发病率并不会因为排除免疫斑点/蛋白质印记阴性的患者而发生改变（附表S5）。另外，在AMA间接免疫荧光滴度低组（=1：40）与高组（≧1:80）没有发现统计学差异，即使前组并没有发现PBC病例（见附表S6）。
讨论
在这项研究中我们发现，在临床诊疗中将近一半的AMA检测阳性与PBC的诊断无关。这一发现重新提出AMAs在人类病理学上重要性的问题。然而，应用经典诊断标准，我们发现13%的患者会诊断为PBC,表明由于AMAs会在非自身免疫性肝病的其他疾病中表现为阳性，这种病会被主治医师尤其内科医师或非肝病专家的医师漏诊。尽管如此，将那些排除在外的假阴性患者考虑在内，我们的随访数据很明显的表明只有一小部分患者在平均4年的随访期后最终发展为PBC。然而，与此同时，这部分患者与那些经过配对的对照组相比，死亡风险增加。
PBC患者有几年的无症状期吴山贡鹅，并在慢性胆汁淤积的患者偶然进行血常规检查时诊断增加。在这种普遍情况下，PBC的诊断因其特异性与敏感性的AMA检查阳性意义重大。AMAs是该病的早期标志物之一。它们可能比组织学或生化变化早几年并在疾病的发展过程中持续存在。这使得AMA检查特别适合评估PBC人群的情况。我们的研究设计基于AMA筛查策略。然而，因为AMA检查有临床适应症，它比不上血清流行病学的研究，因此研究并不能包括所有的AMA阳性患者。因此，我们所估计的发病率和患病率认为比真实数据小。尽管如此，这些估计的数据是法国首次可获知的关于PBC和AMA的流行病学数据，可以和先前在西欧国家报道过的数据相媲美。
新技术和诊断阈值的应用以及筛查人群的类别、年龄和性别结构因素对献血者和健康受试者的系统性筛查发现有0.07%-9.9%的人群AMA阳性。我们研究中发现的AMA的阳性率相对较高，可能与免疫荧光对低滴度AMA检测不明确的特性有关，但更可能是与纳入研究的人群有关。阳性结果所占的比率在40岁以上的女性更大。问题是要探究在这种情况下，AMA是否与潜在的惰性有关，进展缓慢， PBC有必要接受UDCA治疗。考虑日本人群的PBC和AMA的患病率，Shibata等人发现在日本只有0.73%的AMA阳性患者可能会有PBC症状。这些数据和我们的一致，指出AMA相关情况是与PBC相区别的一个范围广但鲜为人知的领域，正如冰山一角，正被我们研究探知。
1996年，Metcalf等人描述了一项包括29例在初次检查时没有任何其他肝病症状但是AMAs阳性患者的队列研究。这29名患者以前都参加过另外一种自身免疫性肝病的筛查。他们中的大多数在筛查时都进行了肝穿，有24名有组织损伤或诊断为PBC,表明在有任何临床症状或生化表现之前，他们已经是PBC。平均随访时间17.8年。在随访期间，仅仅在平均随访5.6年后，76%的患者出现PBC的症状，83%的患者表现为持续的胆汁淤积的异常肝功检查御途网。然而，并没有患者发生门静脉高压或肝硬化，也没有患者死于PBC，这说明疾病在这类患者中进展缓慢。
与英国队列研究不同，我们的研究中只有一小部分(19%)患者在AMA筛查时进行了肝活检。然而，两个研究进行肝穿的人数（n=28）差别较小。与英国结果相反的是，我们的研究中这些患者都没有表现出PBC组织损伤的指征。然而，13%患者的生化指标达到疾病的诊断水平。另外，只有44%的患者在AMA筛查时每一项肝生化检查完全在正常水平，这表明有些患者真的存在轻微的被诊断的PBC。这些患者比同期诊断为PBC的患者更年轻、AMAs滴度更低的事实支持该病的极早期无症状期的假说。然而，与英国研究相反的是，在5年的随访期后只有小部分（16%）的患者出现PBC的临床表现。这些不一致的发现可能是因为纳入研究的人群的本质不同或是研究方法的使用不同（单中心回顾性研究VS前瞻性全国范围内筛查）。尽管如此，我们的研究表明ppk手枪，对PBC特异性线粒体抗原的免疫耐受的损害不一定引发疾病。
我们试图描述这些特殊人群的死亡率。我们的数据显示，在AMA阳性但没有PBC临床表现的患者的死亡风险增加而并非PBC的风险。患者主要死于非原发性肝癌或者血液系统恶性肿瘤，尽管在在理论上PBC不能增加患肝外肿瘤的风险。然而，可以明确的是，AMAs和非肝病相关的死亡之间的关联很可能是伴随疾病的并发症和/或治疗（免疫抑制剂的使用）引起的而并非是由于AMAs导致的后果。遗憾的是我们没有获取到在疾病的筛查阶段AMA检查阴性患者的数据，这妨碍了我们最终获得相关的结论。然而，AMAs是否直接或间接引起死亡风险增加的假设不能完全排除在外。这个假设最终会在越来越多的以非肝病相关的死亡人群的研究中以及越来越多的PBC患者会遭受严重的系统性功能障碍的证据中证实。
我们研究的局限性主要是其固有的大规模研究设计是基于善意的自愿参与的内科医师及他们陈述的数据。这种局限性包括参与率低、数据不全面、易缺失以及对未经审计的数据的不确定性。例如，不能评估AMA随时间的持续阳性情况。然而，对于这样一个大规模的研究，内科医师的参与率（67%）是非常令人满意的，而收集的数据的平均数量同样令人满意。另外，这种内在的局限性可被大量收集的数据及研究人群的代表性平衡掉。
总之，现有的研究注重于占有较高比例的AMA阳性但并未确诊为PBC的患者。这些患者年龄较小，抗体滴度低且经常会有肝脏生化指标轻度异常，支持疾病早期无症状无胆汁淤积阶段。然而，伴有临床症状的PBC的发生率似乎比以前报道的少了。另一方面，这些患者表现为死亡风险增加，而其与AMAs之间的关系仍不确定。
（全文图表略）（本文编辑：赵春燕）